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過表達(dá)靶蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

常州費(fèi)洛斯藥業(yè)科技有限公司...

        外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)表達(dá),外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天;一類是穩(wěn)定表達(dá)(構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株),外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上,使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。

        建立穩(wěn)定細(xì)胞株,基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選,得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。

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      示例:MSLN過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

1.       過表達(dá)人MSLN蛋白(Q13421)的慢病毒載體構(gòu)建,其結(jié)構(gòu)圖如圖 1所示:

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Fig.1  MSLN慢病毒載體圖譜

2.       將制備的慢病毒載體及慢病毒包裝質(zhì)粒PspaX2、PMD2 .0G轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝72小時(shí)后回收病毒;

3.       檢測(cè)病毒滴度,以三種不同的滴度感染CHO-K1宿主細(xì)胞,24小時(shí)后更換培養(yǎng)基;

4.       以未感染慢病毒的CHO-K1細(xì)胞(以下稱為CHO-K1-blank)為陰性對(duì)照組,以感染慢病毒的CHO-K1細(xì)胞(以下稱為CHO-K1-MSLN)cell pool為實(shí)驗(yàn)組,各組加入不同的藥物濃度加壓篩選,選取適當(dāng)?shù)乃幬餄舛群髷U(kuò)大培養(yǎng)4-5代。

5.       以梯度稀釋法在96孔板中培養(yǎng)CHO-K1-MSLN細(xì)胞,5天后觀察細(xì)胞生長并挑選單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

6.       取2E5擴(kuò)大培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞,F(xiàn)ACS buffer洗兩遍后加入陽性檢測(cè)抗體(220812A01)[1],如下圖所示,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSLN蛋白的表達(dá)。

流式檢測(cè)MSLN表達(dá) 

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        費(fèi)洛斯的慢病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株平臺(tái)基于載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選,常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株,為基礎(chǔ)研究(基因功能研究)、藥物篩選(CAR開發(fā)前期scFv篩選)等提供科研助力。

[1]. Yuchun Gu, Le Yin. A kind of CAR-NK cell preparation method of target mesothelin[P].China.

[2].CN109762844A.2019.05.17



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